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Nature Communications| 張昱實驗室首次在單細胞水平系統性地描繪了乳腺癌浸潤B細胞圖譜

發布時間：2021/04/14

2021年4月12日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張昱實驗室在《Nature Communications》雜志在線發表題為“Atlas of breast cancer infiltrated B-lymphocytes revealed by paired single-cell RNA-sequencing and antigen receptor profiling”的文章。該研究首次在單細胞水平系統性地描繪了乳腺癌浸潤B細胞圖譜，描述了乳腺癌浸潤B細胞的13個亞群及其功能，并通過B細胞受體（BCR）序列分析揭示腫瘤中浸潤B細胞可能來自于原位memory B細胞與腫瘤抗原接觸后的不斷分化，發現腫瘤浸潤B細胞與乳腺癌患者的預后存在很好的正相關性。

近年來，旨在治療腫瘤的免疫療法的出現極大地提高了腫瘤患者的生存周期。但是，在臨床表現上，并非所有的腫瘤患者都對免疫治療有響應。如何使得免疫治療更有效是現在亟待解決的問題。已有許多研究為此提供了多種潛在的解決方案。然而，這些研究主要側重于探究腫瘤浸潤T細胞在免疫治療中發揮的功能。不容忽視的是，腫瘤浸潤的免疫細胞中除T細胞外，還有眾多其他細胞類型，例如隸屬于天然免疫系統的巨噬細胞，樹突狀細胞，NK細胞和同樣隸屬于適應性免疫系統的B細胞等。近年來，腫瘤中的其他細胞組分對于免疫治療的影響也逐漸受到重視。

B細胞作為組成免疫系統的重要組分之一，其主要通過分泌抗體，細胞因子，趨化因子或呈遞抗原等途徑行使功能，但是，其在腫瘤發生過程中所扮演的角色在不同研究中存在爭議。以乳腺癌為例，當研究者利用B細胞的經典標記物CD20來評估腫瘤浸潤B細胞與乳腺癌患者預后之間的關系的時候，在不同研究中得到了互相矛盾的結論。造成這種爭議的一個可能原因是不同乳腺癌病人腫瘤浸潤B細胞亞群存在區別，而不同B細胞亞群可能行使不同功能。

本研究利用單細胞轉錄組測序結合單細胞BCR測序分析了10例乳腺癌病人的腫瘤浸潤免疫細胞，并有對應的外周血來源的免疫細胞作為對照。10例病人中有6例是三陰性乳腺癌（TNBC），3例Luminal-A乳腺癌和1例HER2乳腺癌。由于TNBC中的浸潤B細胞含量顯著高于其他乳腺癌亞型，為了避免不同乳腺癌亞型之間潛在的異質性，我們著重分析了TNBC中浸潤的B細胞。通過單細胞轉錄組數據的分析，大體上B細胞可分為四類，na?ve B細胞，memory B 細胞，plasma B 細胞和一類CD14陽性的B細胞，其中腫瘤浸潤B細胞主要為memory B細胞。在單細胞BCR測序數據中，外周血B細胞中germline BCR比例更高，IgM和IgD比例也相對更高，而在腫瘤浸潤B細胞中，我們檢測到更多的體細胞高頻突變（somatic hyper mutation, SHM）和更高的B細胞克隆性。為了探究腫瘤中浸潤B細胞的來源，我們結合了單細胞轉錄組數據和單細胞BCR數據，分析發現腫瘤中浸潤B細胞極有可能是由原位memory B細胞不斷分化而來。

圖1. a. TNBC病人中4個B細胞亞群的tSNE圖展示；b. marker基因表達情況；c. 4個B細胞亞群在PBMC和TNBC組織中分布；d.熱圖展示4個B細胞亞群之間的相同 IGH germline 次數（上）和相同IGH序列次數（下）

利用單細胞轉錄組數據，我們進一步將B細胞分為13群， na?ve B cells (C1 and C2), IgM+CD27+ memory B cells (C3, C4, C6, and C7), IgM+CD27- atypical memory B cells (C5), class-switched memory B cells (C8,C9, and C10), plasma cells (C11), germinal center B cells (C12) 和 CD14+ atypical B cells (C13)。并且通過免疫組化證實了Germinal center B細胞和腫瘤浸潤淋巴結結構的存在。在乳腺癌浸潤B細胞中，我們并未檢測到分泌IL10的調節性B細胞。通過GSEA分析，我們發現腫瘤浸潤B細胞可能主要通過呈遞抗原或分泌抗體的形式行使功能。

圖2. TNBC病人的13個B細胞亞群的tSNE圖展示（左圖）和marker基因表達情況（右圖）

B細胞在乳腺癌發生中所扮演的角色存在爭議，一個潛在的原因是腫瘤浸潤B細胞亞群有著不同的功能，為此，我們需要研究不同的B細胞亞群對乳腺癌發生的影響。利用METABRIC 數據庫中TNBC患者的數據，我們發現na?ve B細胞和memory B細胞對病人的預后有很好的正相關性。更重要的是，相較于經典的B細胞標記物CD20，根據na?ve B細胞和memory B細胞特征基因的表達量可以更好地預測乳腺癌患者患病風險率（Hazard ratios）。

圖3. CD20, na?ve B細胞特征基因和memory B細胞特征基因在METABRIC數據庫中TNBC病人的Kaplan–Meier生存曲線(上圖左側Overall survival, 上圖右側Disease Free Survival)和Hazard Ratios(下圖)

本研究首次在單細胞水平系統性地描繪了乳腺癌浸潤B細胞圖譜，描述了乳腺癌浸潤B細胞的13個亞群及其功能，并通過BCR序列分析揭示腫瘤中浸潤B細胞可能來自于原位memory B細胞與腫瘤抗原接觸后的不斷分化，發現腫瘤浸潤B細胞與TNBC患者的預后存在很好的正相關性。后續，研究B細胞是如何浸潤腫瘤，在腫瘤微環境中如何增殖分化可能為TNBC患者的治療提供新思路。此外，在我們的研究中，我們只詳細地分析了B細胞相關數據，其余大量單細胞測序數據可為相關領域的科研人員提供中重要的研究資源。

張昱實驗室的博士后胡慶濤、洪煜和新鄉醫學院的齊攀醫生為該論文共同第一作者，張昱博士為本文通訊作者。其他作者還包括張昱實驗室的蘆廣慶、麥雪瑩和高琳琳；我所的景志毅、王家文和蔡濤博士；新鄉醫學院的徐升、和小穎和郭予醫生。

張昱博士由國家自然科學基金（81572795和81773304）和北京市政府“百千萬人才計劃” (2019A39)資助。胡慶濤博士由國家自然科學基金資助（31701135）。
論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-021-22300-2